Formação do Biofilme Bacteriano

Nossa percepção de bactérias como organismos unicelulares baseia-se essencialmente no conceito de culturas puras, nas quais as células podem ser diluídas e estudadas a partir de culturas líquidas. Como praticamente todos os conceitos e conhecimentos microbiológicos foram adquiridos a partir do estudo de organismos em culturas puras, somente há alguns anos começamos a entender que, na realidade, a maioria das bactérias se encontra na natureza vivendo em comunidades, de maior ou menor estruturação.
O tipo de "ecologia" que imaginávamos em relação aos procariotos, ou seja, células individuais crescendo de maneira planctônica (livres, em suspensão), raramente é encontrado na natureza. Sabe-se atualmente que, quando em seus habitats naturais, via de regra as bactérias são encontradas em comunidades de diferentes graus de complexidade, associadas a superfícies diversas, geralmente compondo um biofilme, isto é, um ecossistema estruturado altamente dinâmico, que atua de maneira coordenada.
Assim, embora possam ter uma existência planctônica independente, este tipo de vida parece ser eventual.
Os biofilmes, complexos ecossistemas microbianos, podem ser formados por populações desenvolvidas a partir de uma única, ou de múltiplas espécies, podendo ser encontrados em uma variedade de superfícies bióticas e/ou abióticas. Desta maneira, muitos autores definem biofilmes como associações de microrganismos e de seus produtos extracelulares, que se encontram aderidos a superfícies bióticas ou abióticas.
Geralmente, a dinâmica de formação de um biofilme ocorre em etapas distintas. Inicialmente temos or organismos denominados colonizadores primários, que se aderem a uma superfície, geralmente contendo proteínas ou outros compostos orgânicos. As células aderidas passam a se desenvolver, originando microcolônias que sintetizam uma matriz exopolissacarídica (EPS), que passam a atuar como substrato para a aderência de microrganismos denominados colonizadores secundários. Estes colonizadores secundários podem se aderir diretamente aos primários, ou promoverem a formação de coagregados com outros microrganisos e então se aderirem aos primários.
Comportamento coletivo
Há várias décadas, foi proposto que as bactérias poderiam corresponder a organismos interativos, capazes de atuar coletivamente, facilitando sua adaptação às alterações ambientais. Para que um biofilme de uma ou várias espécies seja formado, é necessário o estabelecimento de um comportamento multicelular, que se reflete em atividades coordenadas de interação e comunicação dos vários organismos. Assim, os biofilmes não são simples camadas viscosas contendo organismos. Estes representam sistemas biológicos altamente organizados, onde as bactérias estabelecem comunidades funcionais estruturadas e coordenadas.
Um dos mecanismos de comunicação interbacteriana que vem se mostrando extremamente importante na formação e desenvolvimento de biofilmes corresponde ao quorum sensing.

Disponibilidade de nutrientes e cooperatividade metabólica
Os canais aquosos dos biofilmes podem ser comparados a um sistema circulatório primitivo, permitindo a troca de nutrientes e metabólitos, assim como a remoção de metabótilos potencialmente tóxicos. Em um biofilme, torna-se possível a cooperação metabólica. Por exemplo, a degradação de compostos orgânicos complexos, originando metano e CO₂ durante uma digestão anaeróbia, requer pelo menos três grupos de organismos. As bactérias fermentativas iniciam o processo, gerando ácidos e álcoois, que são utilizados por bactérias acetogênicas. Finalmente, as metanogênicas convertem o acetato, CO₂ e hidrogênio, produzindo metano.
Os biofilmes são ambientes ideais para o desenvolvimento de relaçoes sintróficas, que é um tipo de simbiose onde dois tipos de organismos metabolicamente distintos dependem um do outro para utilizarem certos substratos, na produção de energia.

Aquisição de novas características genéticas
Várias bactérias possuem plasmídeos, conferindo as mais diversas características. Estes podem ser transferidos horizontalmente por conjugação, para diferentes espécies presentes em um bioflme. Estudo foram realizados com placas dentais artificiais, formadas inicialmente por bactérias do gênero Streptococcus. Uma linhagem de Bacillus, contendo um transposon conjugativo albergando genes de resistência à tetraciclina, foi inserida no sistema e transferiu este transposon para células de Streptococcus.
A transdução pode, teoricamente, ser responsável pela transferência horizontal de genes em biofilmes. Tal hipótese baseia-se no fato de sistemas marinhos e de água doce contêm uma enorme abundância de bacteriófagos (cerca de 10⁸/ml), sendo responsáveis pela lise de um grande número de bactérias. Diariamente, de 10 a 20% da população bacteriana é lisada por fagos, os quais têm relevante impacto na cadeia alimentar microbiana uma vez que podem aumentar as taxas de mortalidade e/ou reduzir as taxas de crescimento em todos os níveis tróficos. Estudos recentes revelam que os fagos podem estruturar ou restruturar comunidades microbianas. Em uma análise, onde uma população de cianobactérias foi praticamente exterminada pelos fagos, observou-se a presença de novas espécies capazes de degradas os compostos orgânicos que surgiram.

Papel dos biofilmes nas doenças
Até o momento, a vasta maioria das doenças infecciosas vem sendo tratada eficientemente com antibióticos entretanto, de acordo com as pesquisas mais recentes, sabemos que tal tipo de estratégia pode ser ineficaz em duas situações: 1) com organismos exibindo resistência inata à droga e 2) em bactérias presentes em biofilmes. Em um biofilme, as bactérias podem ser 1000 vezes mais resistente a um antibiótico, quando comparadas às mesmas células planctônicas, embora os mecanismos envolvidos nesta resistência sejam ainda pouco conhecidos. Dentre os possíveis mecanismos, acredita-se que possa haver a inativação da droga por polímeros ou enzimas extracelulares, ou a ineficiência da droga em decorrência de taxas de crescimento muito lentas no interior dos biofilmes.
Infecções assciadas a biofilmes geralmente são de natureza recorrente, visto que as terapias antimicrobianas convencionais eliminam predominantemente as formas planctônicas, deixando as células sésseis livres para se reproduzir e propagar no biofilme após o tratamento. Para tornar o quadro ainda mais grave, as bactérias presentes nos biofilmes encontram-se mais protegidas contra o sistema imune do hospedeiro.
Exemplos típicos de doenças associadas a biofilmes incluem as infecções de implantes tais como válvulas cardíacas, catéteres, lentes de contato, etc.
Os biofilmes podem ainda promover doenças se formados em tecidos, tais como nas infecções pulmonares provocadas por Pseudomonas aeruginosa, em pacientes com fibrose cística, que são suscetíveis a infecções crônicas por esta bactéria. A periodontite é outro exemplo de doença provocada por biofilmes. O principal microrganismo associado a esta doença, Porphyromonas gingivalis, coloniza uma grande de superfícies orais direta ou indiretamente, sendo então capaz de invadir as células das mucosas e liberar toxinas.

fonte:http://www.unb.br

Morfologia de algumas bacterias

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25º Congresso Brasileiro de Microbiologia

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Coloração de Endósporos

Preparo do esfregaço

Suspender uma pequena porção da amostra bacteriana a ser corada em uma gota de água ou solução salina 0,85%, sobre uma lâmina de microscópio, espalhando a gota. Este procedimento deve ser feito com um alça bacteriológica flambada ou um palito de madeira esterilizado. Deixar o material secar e, em seguida, fixá-lo com calor, flambando rapidamente a lâmina acima da chama de um bico de Bunsen.

Aplicação do corante primário

Cobrir toda a sua superfície da lâmina com o corante verde de malaquita e manter a lâmina sobre a chama do bico de Bunsen até o corante emitir vapores. Deixar esfriar por cinco minutos. Enxaguar a lâmina com água.

Aplicação do corante secundário

Cobrir toda a sua superfície da lâmina com o corante safranina ou fucsina; deixar em repouso por trinta segundos. Enxaguar a lâmina com água e tocar as bordas com papel absorvente para remoção do excesso de água.

Resultados

Examinar a amostra ao microscópio óptico. As células vegetativas apresentarão coloração avermelhada e os esporos serão corados em verde. As figuras 1 e 2 são micrografias ópticas de Bacillus subtillis e Bacillus cereus, respectivamente, onde as células vegetativas aparecem coradas em vermelho e os endósporos aparecem corados em verde.

Neisseria gonorrhoeae

O gênero Neisseria corresponde um gênero muito grande de bactérias que estão principalmente situadas na nasofaringe. As duas espécies mais importantes clinicamente são a N. gonorrhoeae (Gonococo) e a N. meningitidis (Meningococo), que são os agentes da gonorréia e da meningite respectivamente. Tintorialmente, são diplococos gram-negativos. As duas espécies apresentam resistência natural à vancomisina e à polimixina. São fermentadores da glicose e apresentam crescimento no meio Thayer-Martin a 35°C.

Bacillus subtilis

Coloração de Gram

Preparo do esfregaço

Suspender uma pequena porção da amostra bacteriana a ser corada em uma gota de água ou solução salina 0,85%, sobre uma lâmina de microscópio, espalhando a gota. Este procedimento deve ser feito com um alça bacteriológica flambada ou um palito de madeira esterilizado. Deixar o material secar e, em seguida, fixá-lo com calor, flambando rapidamente a lâmina acima da chama de um bico de Bunsen.

Aplicação do corante primário

Cobrir toda a sua superfície da lâmina com o corante cristal violeta; deixar em repouso por um minuto. Descartar o excesso de corante ou enxaguar a lâmina com água.

Aplicação do fixador

Cobrir toda a sua superfície da lâmina com lugol; deixar em repouso por um minuto. Descartar o excesso do fixador ou enxaguar a lâmina com água.

Descoloração

Com a lâmina inclinada, despejar algumas gotas de álcool-acetona 1:1 v:v (descolorizador) para remover o complexo cristal violeta-lugol de células Gram-negativas. Este procedimento não pode exceder a cinco segundos, pois o descolorizador poderá remover o corante cristal violeta das células Gram-positivas. Em seguida, enxaguar a lâmina com água para remover excesso de solvente.

Aplicação do corante secundário

Cobrir toda a sua superfície da lâmina com o corante fucsina básica; deixar em repouso por um minuto. Enxaguar a lâmina com água e tocar as bordas com papel absorvente para remoção do excesso de água.

Microscopia

Examinar a amostra ao microscópio óptico. Na aplicação da técnica de coloração de Gram de organismos desconhecidos, pode-se utilizar como controles uma bactéria Gram-positiva e uma Gram-negativa, conhecidas, preparando-se lâminas com três esfregaços, sendo o esfregaço central o da bactéria desconhecida. Desta forma, as bactérias controles indicarão se a técnica foi ou não bem sucedida. Sugere-se utilização de Bacillus subtilis e Escherichia coli como controles Gram positivo e Gram negativo, respectivamente.

fonte:http://www.fam.br/microrganismos/metodo_coloracao_de_gram.htm

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